這種共聚焦技術利用激光作為激發(fā)光源，將激光聚焦于樣品中的某一點，這樣只有該點附近的區(qū)域有熒光，其他沒有被激發(fā)的部位沒有熒光，這一區(qū)域發(fā)出的熒光反射到光電倍增管，在光電倍增管前設有1 個計算機控制的可調節(jié)針孔， 保證只有被激發(fā)點發(fā)出的熒光才能到達光電管，而附近其他點所發(fā)出的熒光被擋在視野之外。采用計算機控制激光和針孔， 對細胞內的某一層面進行掃描，可以獲得清晰的二維圖像。

    這一技術成像速度快、自動化程度高。但激光具有單色性，一種激光器只能發(fā)出某幾個特定波長的激光，而熒光染料的種類很多，其激發(fā)光波長各不相同，這樣在使用某種型號的激光器時，只有少數(shù)幾種熒光染料可以使用， 而其他大多數(shù)的染料不能使用；目前同時配備數(shù)個不同激光器或多光子脈沖激光器的激光共聚焦系統(tǒng)的出現(xiàn)，雖然可以解決這一難題，但是設備結構復雜、價格昂貴，維護保養(yǎng)要求較高。

    這一技術是隨著計算機軟件技術的發(fā)展出現(xiàn)的，與激光共聚焦的原理有極大的區(qū)別， 它在普通的熒光顯微鏡上加上1 個計算機控制的高分辨率、帶有制冷裝置(以提高信噪比) 的CCD 攝像機， 攝像機獲取的圖像由計算機進行解卷積(deconvolution) 計算， 這種數(shù)字式圖像處理可以將聚焦平面以外的圖形信號刪除， 保留高清晰度的焦平面信息。

    這一系統(tǒng)硬件配備比較簡單，價格遠遠低于激光共聚焦系統(tǒng)；由于使用可以發(fā)出連續(xù)光譜的高壓汞燈或氙燈作為光源，使這一技術幾乎可以用于所有的熒光染料，應用范圍廣泛， 其機械部分組成簡單，靈活性高。這一技術的不足在于其圖像獲取、計算對計算機的依賴性高，圖象獲取時間相對較長，實驗時除要分析的層面被激發(fā)外，細胞內其他部位也被激發(fā)， 增加了熒光染料的光淬滅，對某些容易被光淬滅的染料會造成明顯的影響；隨著計算機和攝像技術的發(fā)展，這些問題也在逐步解決。